01 K+F háttér és kihívások
1.1 Az MK-0616 gyógyszerfejlesztési háttere
Az Enlicitide Decanoate (más néven MK-0616) az első teljesen de novo tervezett orális makrociklusos peptid PCSK9 inhibitor, amely az alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin (LDL-C) csökkentésére és az érelmeszesedéses szív- és érrendszeri betegségek kezelésére szolgál.
Amint a fenti ábrán látható, az MK-0616 mellett a klasszikus példák ezen a területen még a vancomycin antibiotikum (2), a paclitaxel kemoterápiás szer (3) és az eribulin (4) rákellenes gyógyszer. A 2. és 3. vegyületek összetett szerkezete azt jelenti, hogy tényleges szintézisük még mindig természetes termékeken alapuló félszintetikus módszereken alapul; ezzel szemben az Eisai-csapat több mint 60 lépésben érte el a 4-es vegyület teljes szintézisét, ami mérföldkövet jelent a poliketidvegyületek szintézisében.
Ami az MK-0616-ot illeti, a kémiai szerkezete rendkívül egyedi: ez az első olyan molekula, amelyet teljesen a semmiből terveztek (nem pedig természetes forrásokból származtatták volna); továbbá, mint napi szájon át szedhető PCSK9-inhibitor, amelyet szív- és érrendszeri betegségek kezelésére, nem pedig onkológiai vagy fertőzésellenes alkalmazásokra szánnak, globális kereslete messze meghaladja a hagyományos innovatív gyógyszerekét, így több száz kilogrammtól több tonnáig terjedő mennyiségben kell előállítani.
1.2 Szintetikus kihívások és stratégiák
Az MK-0616 molekuláris összetettsége szigorú követelményeket támaszt a folyamatfejlesztéssel szemben.
Szerkezeti jellemzők: Bár az MK-0616 egy mRNS-megjelenítési technológiával azonosított makrociklusos peptidből származik, 6 nem kanonikus aminosavat (összesen 8 aminosavegységet), egy 37 tagú makrociklust, egy ammóniumsó oldalláncot (10) és egy nem peptid fragmentumot (13) tartalmaz, amely a hagyományos szilárd peptid szintetizálási technikát teszi lehetővé. hatástalan, amint az alább látható.
A megválaszolandó alapvető kihívások
1、A poláris intermedierek stabilitása (különösen az ammóniumsó-fragmensek esetében, ahol az elleniont a teljes folyamat során ellenőrizni kell)；
2、A nagy gyűrűzárás szelektivitása (az összeszerelési sorrend optimalizálását igényli 10 blokk között)；
3、Nagyítási kihívások (kerülje a kromatográfiás tisztítást; biztosítsa a milligramm-kilogramm áteresztőképességet)；
Ezért, a kutatók által javasolt kulcsfontosságú döntés a következő：
1、oszd meg és uralkodj：Előnyben részesítse az "északi fragmens" (egy 17 tagú gyűrű, amely nem kanonikus aminosavakból áll az 5., 6. és 7. pozícióban) felépítését, és egyszerűsítse a makrociklusos hasítási stratégiát retroszintetikus elemzéssel (például az 5. és 8. pozíció közötti amidkötés kiválasztásával).
2、A terminál oldalláncának bemutatása：A poláris ammóniumsó töredéket (10) az utolsó beépítési lépésre kell fenntartani, hogy elkerüljük a közbenső tisztítással kapcsolatos problémákat.
3、A sav rugalmas alkalmazása–bázissemlegesítési reakciók (RCM)：A 7-es pozícióban n-hexánhoz kapcsolódó lánc képződik–13; ez a reakció kiváló ortogonalitást mutat, és több lépésben is végrehajtható.
A stratégiák ezen sorozatával a kutatók végül létrehoztak egy méretezhető szintetikus útvonalat, megnyitva az utat a klinikai értékeléshez.02
02 Szintetikus stratégia és optimalizálás
Analitikai vizsgálatokon keresztül a kutatók többlépéses, többgenerációs optimalizálást hajtottak végre a kulcsfontosságú makrociklusos fragmentumban (északi fragmentum), és optimalizálták a déli fragmentum összeállítását a végtermékkel.
2.1 Az északi szegmens többgenerációs optimalizálása:
Első generáció– 37 iteráció
A nem kanonikus aminosavak (például a 3-hidroxi-prolin) szintézise alacsony hatékonyságot mutat, mivel nem hatékony ciklizációs reakciókon alapul—mint például a Dieckmann kondenzáció—valamint királis felbontás; továbbá ez az eljárás több védőcsoport-manipulációt és számos kromatográfiás tisztítást igényel, amint azt az alábbi ábra szemlélteti.
Mindezek a tényezők korlátozzák a célfragmensek nagy léptékű szintézisét.
Második generációs szinkron rendszer
Áttörést ért el a biokatalízis: a ketonredukció (KRED) bevezetése lehetővé tette a nagyon hatékony és sztereoszelektív redukciót.β-hidroxi-észterek; ezen túlmenően, módosított TrpB enzimet használtak a fluorozott triptofán szintézisére, ezáltal kiküszöbölve a királis rezolválás szükségességét. Ennek eredményeként a szintetikus lépések száma csökkent, és a védőcsoportok használata minimálisra csökkent, amint azt az alábbi ábra szemlélteti.
Ezt a szintetikus utat a Northern fragmentum optimalizálására a klinikai fejlesztésben is alkalmazták; a strukturális stratégiából adódó lehetőségek azonban szükségessé tették a fragmentumszintézis út további optimalizálását.
Először is, a három késői kristályosodási intermedierre vonatkozó kulcsfontosságú megállapítások kritikus pontot jelentenek a tisztaság ellenőrzéséhez; ezért elengedhetetlen a szintetikus út módosítása e három intermedier elfogására.
Másodszor, az olefinek ciklotrimerizációs reakcióját a szintézis folyamata során a lehető legkésőbb végezni. Ez a megközelítés azon a megfontoláson alapul, hogy a ruténium katalizátorok növelhetik a benzotiuramin előállításának összköltségét; ennek a reakciónak a szintetikus út utolsó szakaszában történő végrehajtása így jelentősen csökkentheti a költségeket.
Ezért ez megkönnyítette a harmadik generációs megközelítés optimalizálását.
Harmadik generációs közös lépcsős rendszer
Az L-prolin enzimes hidroxilezéssel közvetlenül oxidálódik 3-hidroxi-prolinná, amelynek sztereoszelektivitása meghaladja a 99:1-et; kulcsfontosságú intermediereket azonosítottak, mint például a benzolszulfonát só kristályosságát, amely lehetővé tette a kromatográfiás tisztítás elkerülését; moduláris összeállítást alkalmaztunk, az aminosav-kapcsolási szekvencia módosításával és a védőcsoport-stratégia egyszerűsítésével együtt, amint azt az alábbi ábra szemlélteti.
A harmadik generációs szintetikus MK-0616 Northern fragmentum különbözik az előző két generációban szintetizált fragmentumoktól. Ezt a szelekciót a kristályos pentanoát 91 azonosítása vezérelte, amelyből hiányzik a treonin aminosav (a szintézis során később beépül). Ez a só nagy hozammal és tisztasággal izolálható, és rendkívül stabil intermediert biztosít, amely kulcsfontosságú intermedierként tárolható a szintézis folyamata során.
A harmadik generációs optimalizálással az újonnan tervezett északi töredék (91) szétválasztása már csak 14 lépést igényel.—mindössze egyharmada az első generációs szintézishez szükséges lépések számának. Továbbá fontos megjegyezni, hogy a harmadik generációs protokollban a leghosszabb lineáris sorozat több mint felére csökkent, 20 lépésről 9 lépésre csökkentve.
2.2 A déli töredék optimalizálása
Első generáció, 15 lépésből áll
A kereskedelmi beszállítóktól nagy mennyiségben beszerzett alapanyagokból kiindulva a 9 lépésből álló folyamat jelenti a leghosszabb lineáris sorozatot, ahogy az alábbi ábrán is látható.
Második generációs szinkron rendszer
A második generációs szintézisben nem a lépések számát javították, hanem az általános hatékonyság- és tisztaságszabályozást, amint azt az alábbi séma szemlélteti. After thousands of trials, a Southern blot fragment called leelamine salt (99) was identified.
Ennek a két vegyületnek az alkalmazásáról korábban már kimutatták, hogy nem királis oldószerként szolgál karbonsavak esetében; ennek következtében a (99) kristályos só meglepő módon nagy tisztaságú anyagként állítható elő, így elkerülhető a szintézis előző generációjában szükséges kiterjedt preparatív HPLC munka.
2.3 A végtermék összeszerelése
Mind az első generációs északi fragmens, mind a déli fragmentum második intermedierje könnyen védhető, hogy megkapjuk a 61 lineáris prekurzort, amint az az alábbi ábrán látható; a cikloolefin metatézis termék hozama azonban nagyon alacsony.
Ettől függetlenül a kutatók sikeresen alkalmaztak egy másik szekvenciát, amely lehetővé tette az MK-0616 első méretezhető szintézisét, amint azt az alábbi séma szemlélteti.
Az első generációs enaldehid sókat egy 63 lépésből álló eljárással szintetizálták, amely az oldalláncok molekulamagba történő beépítésével kezdődik, nagy hozamú amidálással, majd SFC-tisztítással; ezen lépések közül a 28. lépés jelenti a leghosszabb lineáris sorozatot.
A második generációs végtermék-kombináció az alábbi ábrán látható.
A célterméket megcélzó északi és déli fragmensek útvonalának optimalizálásával mindkét megközelítés lapos fragmens kristályos intermediereket használhat a szintézis végső szakaszába történő előrelépéshez.
Ez a kapcsolási reakció kellően tiszta ahhoz, hogy közvetlenül a következő lépésben folytassuk a nyers reakciót alkalmazva.
Összességében az MK-0616 második generációs szintetikus útja 43 lépést igényel, amelyek közül 21 lépés a leghosszabb lineáris sorozat. Ez a sorozat egyharmadával csökkenti a lépések teljes számát és a leghosszabb lineáris sorozat hosszát az első generációs folyamathoz képest.
03 Kulcsfontosságú technológiai innováció
A teljes optimalizálási folyamat elemzése számos újítást tár fel a kulcsfontosságú technológiák terén, mint például:
1、Biokatalízis technológia:KRED dinamikus kinetikus felbontás; Triptofán analógok TrpB enzim által közvetített szintézise; hidroxilcsoportok közvetlen bevitele prolin-hidroxilázon keresztül; stb.
2. Kristályosítás által vezérelt tisztítás: Több közbenső lépés—mint például a Northern blot fragmensek metilszulfonátja vagy a Southern blot fragmensek leelamin sója—A kristályosítási tisztítást alkalmazzák, így nincs szükség kromatográfiás oszlopokra.
3. Ortogonális védőcsoport stratégia: rugalmas váltás a védőcsoportok, például a Boc és a Nosyl között a többlépéses reakciók szelektivitásának biztosítása érdekében.
4. Zöld kémiai szempontok: a nehézfém-katalizátorok (pl. ruténium-katalizátorok) használatának csökkentése és az RCM-reakció egy későbbi szakaszba helyezése a gyártási költségek csökkentése érdekében.
04 Összegzés és kitekintés
Ez a cikk a biokatalízis és a kémiai szintézis rugalmas integrációját mutatja be, miközben hangsúlyozza a kristályosítási folyamatok kulcsfontosságú szerepét, és egy moduláris tervezési megközelítést alkalmaz – ezáltal egy szisztematikus módszertant mutat be, amely a laboratóriumi feltárástól az ipari méretű gyártásig terjed. Ez a munka példaértékű példa a komplex molekulaszintézis területén: az első generációs protokoll 63-ról 43-ra csökkent a lépések teljes száma a második generációs protokollban, a hozamok közel 1000-szeresére nőttek, és lehetővé vált a tonnaléptékű gyártás. A teljes folyamat során stratégiai hangsúlyt fektetnek a kristályosítási lépésre, elkerülve ezzel a kromatográfiás tisztítást – ez a tulajdonság kiválóan alkalmassá teszi a tonnaléptékű gyártásra. Ezenkívül ez a tanulmány technikai sablont biztosít más összetett makrociklusos peptidek szintetikus megközelítéséhez.
