A biokatalitikus kaszkádok lehetővé teszik az Enlicitide makrociklusos peptid előállítását

Az MSD vizsgálati orális PCSK9-gátlója, az enlicitid-dekanoát (MK-0616) az első olyan orális makrociklusos peptid PCSK9-inhibitor, amely jelentős mértékben csökkenti az LDL-C-szintet emberben. Az Enlicitidet monociklusos peptidek mRNS-megjelenítő képernyőjéből fejlesztették ki, majd nem peptides keresztkötésekkel stabilizálták, hogy három fuzionált makrociklust tartalmazó szerkezetet hozzanak létre. Ez az összetett oktapeptid hat nem természetes és két proteinogén aminosavat tartalmaz, amelyeket 12 amidkötés és egy központi, hat szénatomos lánclinker köt össze. A hagyományos kémiai szintézis 43 lépést, védőcsoport-kezelést (a szintetikus lépések közel fele), kromatográfiás tisztítást és egy erősen híg ruténium katalizált gyűrűzárási metatézis lépést igényel, korlátozva a méretezhetőséget és a fenntarthatóságot.

Kemoenzimatikus gyártásfejlesztés

Az MSD tudósai tömör és konvergens kemoenzimatikus eljárást dolgoztak ki az enlicitid-dekanoát (1) előállítására, amelyet a monomerek aminosav-ligázok általi közvetlen kapcsolásával, biokatalitikus peptidfragmensek ligálásával és észterázok és imin-reduktázok felhasználásával végzett makrociklizálással kombináltak.

Kulcsfontosságú eredmények

Három enzimes kaszkád összeállítás ATP-grap ligázok felhasználásával

- Három enzimes kaszkád (két mesterségesen kialakított ATP-grasp ligáz + ATP újrahasznosítás) tetrapeptidet állít össze nem védett aminosavakból. Az ATP-grap ligázok (konkrétan ATP-függő aminosav ligázok, AAL-ok) olyan enzimek, amelyek katalizálják az amidkötés kialakulását nem védett aminosavak vagy peptidek között, energiaforrásként ATP-t használva. Mechanizmusuk egy vegyes anhidrid intermedieren keresztül megy végbe, amely lehetővé teszi a közvetlen kapcsolást anélkül, hogy a nukleofil aminon vagy az aktivált acildonorokon védőcsoportokra lenne szükség. Ebben a tanulmányban a kutatók a Bifidobacterium adolescentisből (BaAAL) származó ATP-grap ligázt és a módosított variánsokat (Trp-BaAALEng és Phe-BaAALEng) használták, hogy szelektíven meghosszabbítsák a dipeptidet két nem természetes aminosavval (triptofán és fenilalanin analógok) egy egyedényes kaszkádban. Ezeknek a ligázoknak van egy keskeny, eltemetett elektrofil zsebük, amely egyetlen aminosavat fogad el elektrofilként (C-terminális szubsztrát), de hosszabb peptideket is képes befogadni N-nukleofilként. Ez a szelektivitás ideálissá teszi őket a szekvenciális, védőcsoport-mentes peptid-összeállításhoz a C-terminálistól az N-terminálisig. Az elfogyasztott ATP-t újrahasznosítják egy polifoszfát-kináz (FbPPKWT) segítségével, foszfátdonorként olcsó hexametafoszfáttal.

Műszaki észteráz (RsEstEng) regioszelektív makrolaktamizáció

- A módosított észteráz (RsEstEng) katalizálja a regioszelektív makrolaktamizációt, hogy létrehozza a Northern fragmentumot (73%-os hozam, 52 kg-os skála). Az RsEstEng egy vad típusú karboxi-észterázból (RsEst) származik, amelyet Roseibacillus sp. Natív funkciója az észterkötések hidrolízise. Irányított evolúció révén a kutatók az enlicitid Northern fragmentumának (4) szintézisében a regioszelektív makrolaktamizáció katalizátorává alakították – egy makrociklusos amidkötés kialakulásához. Elfogadja a lineáris tetrapeptid (9) stabil, terjedelmes terc-butil-észterét acildonorként a makrociklusos peptid (4) előállításához, és így intramolekuláris amidkötést hoz létre. Szelektív ciklizálást ért el kimutatható oligomerek nélkül és csak 0,8% észterhidrolízis mellékterméket, még az előző enzimes kaszkád magas ionerőssége mellett is.

Művelt tioészteráz (BlTEEng) intermolekuláris ligálás

- A módosított tioészteráz (BlTEEng) epimerizáció nélkül hajtja végre az északi (4) és a keleti fragmentumok (3) intermolekuláris ligálását. A BlTEEng egy tioészteráz (TE) domén módosított változata, amelyet eredetileg a Brevibacillus laterosporus (BlTE) nem riboszómális peptid-szintetázából (NRPS) vágtak ki. A vad típusú tioészterázok az NRPS rendszerekben tipikusan katalizálják a makrociklizációt vagy lineáris peptidek felszabadulását egy hordozófehérjéből tioészter kötésen keresztül. A BlTE tervezett változatai bizonyos aktivitást mutattak, de a dimer melléktermékeket részesítették előnyben. Az enzimtechnológia az enzimet az intermolekuláris ligálás katalizálására fordította, stabilabb izopropil-oxoészterek felhasználásával a természetes, hidrolitikusan labilis tioészterek helyett.

Négy enzimes kaszkád reduktív aminálási makrociklizálás

- Négy enzimes kaszkád (PsIREDEng, KsKREDEng és kofaktor-újrahasznosító enzimek, StLDHWT, TvADHWT) reduktív aminálásos makrociklizációt ér el, így biciklusos diamint képez (69%-os hozam, 46 kg-os skála). A KsKREDEng a Kyrpidia sp. Egy benzil-alkohol vegyület (10) oxidációját katalizálja tranziens aldehiddé (11) a NAD+-tól függően. A PsIRED egy imin-reduktáz a Pseudogymnoascus sp. Ez NADPH-függő. A PsIREDEng katalizálja az aldehid (11) és a meglévő amin reduktív aminálását (12) ciklikus imin előállítására, amelyet a (13) szekunder amin makrociklussá redukál. Az StLDHWT regenerálja a NAD+-t az oxidációs lépéshez a piruvát laktáttá redukálásával, míg a TvADHWT az izopropanolt acetonná oxidálva regenerálja a NADPH-t a reduktív lépéshez.

Végső makrociklizálás mesterséges PBP-tioészterázon keresztül

- A Western fragmentum (2) kémiai kapcsolása, majd a módosított penicillin-kötő protein-tioészteráz (SsPBP-TEEng) lezárja a végső makrociklust magas koncentrációban (70 g/L) – ezzel túllépve a tipikus hígítási korlátot (hagyományos szintézisben 5 g/l). A teljes folyamat három kaszkád lépést foglal magában, 7 mesterséges + 3 segédenzimet, 39%-os összhozamot, több kilogrammos méretű demonstrációt, >99%-os tisztaságot, kromatográfiát és védőcsoportokat. Ez a munka fenntartható, méretezhető tervezetet nyújt a komplex makrociklusos peptidek előállításához, drámai módon csökkentve a lépések számát és a veszteséget, miközben javítja a hatékonyságot és a betegek hozzáférését.